Biofilms en la industria alimentaria

En la estructura de un biofilm, los microorganismos encuentran un punto de anclaje, una reserva de nutrientes y una protección efectiva frente a los desinfectantes.

Un biofilm puede permitir que cepas de patógenos residan de forma estable en ambientes de producción de alimentos y sean el origen de brotes de toxiinfecciones alimentarias graves para los consumidores.

Prevenir, detectar, controlar y eliminar los biofilms, contribuye eficazmente a mejorar la inocuidad de los alimentos.

Introducción

La clave de todo está en el estándar de limpieza. ¿Qué se considera “limpio”, en un ambiente de elaboración de alimentos? Lamentablemente, no hay normativas microbiológicas de ambiente. Lo que sí hay, son criterios de higiene de proceso donde se definen varios microorganismos indicadores (Salmonella, E. coli, enterobacterias, B. cereus), donde, si el ensayo da positivo, se deben tomar acciones correctivas basadas en el HACCP (Reglamento CE 2073/2005).

Uno de los principales desafíos a los que ha de hacer frente la industria agroalimentaria es la presencia de biofilms en nichos de equipos y materiales y en las superficies de la industria alimentaria. Probablemente, constituye la causa principal de contaminación durante el proceso.

Su formación se produce tanto en sistemas cerrados (tuberías, bombas, membranas, intercambiadores, etc.), como en sistemas abiertos (mesas de trabajo, cuchillos, cintas de transporte, maquinaria, etc.), debido a la presencia de microorganismos y de condiciones (superficies, nutrientes, humedad, sustrato, etc.), que facilitan su implantación y desarrollo.

Definimos los biofilms como una asociación de microorganismos adheridos a una superficie: los microorganismos tienen una tendencia natural a adherirse a las superficies para multiplicarse y envolverse en una matriz viscosa, compuesta de polímeros extracelulares (EPS) que ellos mismos producen y que les permite protegerse y sobrevivir en un ambiente hostil.

Un buen diseño higiénico de procesos, instalaciones y equipos, y un sistema de gestión de la higiene, limpieza y desinfección eficaz, son los prerrequisitos indispensables para la lucha efectiva contra los biofilms.

Herramientas y técnicas

Hay varias herramientas, no excluyentes, para prevenir su desarrollo. Por ejemplo, las superficies de contacto con propiedades antimicrobianas permanentes (como el recubrimiento con Alistagen: una formulación microencapsulada de hidróxido de calcio), mantener las superficies secas en instalaciones y equipos, el empleo de métodos de detección de materia orgánica o de microorganismos sobre superficies por bioluminiscencia y la utilización de sensores de superficie y de la microscopía de epifluorescencia.

Otras técnicas y estrategias para combinar para así controlar y evitar los biofilms son el uso de sistemas enzimáticos para la eliminación de biofilms, el diseño adecuado del uso de desinfectantes o el control de patógenos mediante bacteriófagos específicos. También se ha visto el uso de electro pulido, donde se coloca el acero inoxidable en un baño ácido, luego se pasa una corriente eléctrica a través de la solución, que lograría que se quede cargada la superficie, dificultando el anclaje de los microorganismos.

Cuando la industria detecta incidencias durante los controles de los indicadores higiénicos de superficies o de producto acabado se debe a que  los protocolos de limpieza y desinfección de las superficies y de los equipos no son del todo eficaces ante la presencia de biofilms, por lo que es hora de implantar estrategias específicas dirigidas a la detección, control y eliminación de biofilms, para optimizar el control de las condiciones higiénicas de los procesos y de la inocuidad alimentaria de los productos elaborados.

Fisiología

Para su gestión, hay que comprender su fisiología. Para ello, hay investigadores que han diferenciado en la formación de biofilms cinco fases diferentes:

1. transporte de nutrientes, materiales inorgánicos y orgánicos a la superficie
2. adsorción de una película de acondicionamiento que contengan nutrientes inorgánicos y orgánicos
3. adjunto de células microbianas a la superficie mojada e inicio del  crecimiento
4. metabolismo bacteriano dentro de la película
5. interrupción celular y desprendimiento del biofilm

Una eliminación adecuada de biofilms requiere el uso de un material que pueda penetrar y solubilizar los polímeros que componen los biofilms. P.e., al exponer los biofilms al cloro en los niveles de 25, 50 y 200 partes por millón (ppm) y yodo en 25 ppm, resulta en una supervivencia de contacto tanto como cinco minutos.  El compuesto que mejor actúa es el ácido de peróxido de hidrógeno/peracéticos, que al parecer tiene la capacidad de penetrar en el biofilm.  

Para ello también es fundamental el método de muestreo: no es lo mismo un conteo en placa convencional que un ensayo de enriquecimiento para tener un indicador fiable de la eficiencia del saneamiento. En un estudio de Farrel y Co. (3), se ha observado que luego de limpiar y desinfectar con cloro o peroxiacético, se recuperaban raramente E. coli viables por conteo en placa, que correspondían a células potencialmente dañadas que permanecían en la superficie, o a estar por debajo del número de detección (5 ufc/cm2).

Se sabe que la aplicación de antibióticos, usualmente efectivos contra bacterias en medio libre, es inefectiva una vez que los patógenos han formado el biofilm, ya que son hasta 1.000 veces más resistentes a antibióticos y 500 veces más resistentes a agentes desinfectantes.

Resistencia

Los motivos de esta resistencia incrementada, entre otros son:

• Neutralización: probablemente por la unión del EPS al agente desinfectante
• Inhabilidad para penetrar
• Cambios estructurales de membrana: cambio de polaridad de los fosfolípidos de las membranas, así como el de síntesis de nuevas proteínas de membrana, o su inhibición de determinadas bombas para reducir el influjo.
• Menor superficie celular  expuesta
• Eflujo por bombas de membrana, sintetizadas por stress,
• Degradación enzimática, y su uso como fuente de carbono
• Síntesis de novo de genes de resistencia en DNA y plásmidos,
• Proteínas relacionadas con la regulación de la movilidad del flagelo.
• Adaptación de los micoorganismos: es probable que su anclado a las superficies haya evolucionado como un mecanismo de mejor fitness para protección contra el medio ambiente

Programa de 7 pasos

Se propone un programa de 7 pasos para evaluar el sistema de gestión de prevención de biofilms:

1. Identificar un área para probar el sistema.  Se recomiendan los “hot spots”, que pueden ser aquellos lugares donde tradicionalmente se ha asociado las recuperaciones de producto con la presencia de un biofilm: drenajes, condensaciones, arreglos temporales. O aquellos detectados durante una inspección a planta o una auditoría interna o externa.
2. Seleccionar qué variable se pondrá a prueba para evaluar la eficacia del sistema. Ejemplos de los tipos de variables para seleccionar pueden ser el microorganismo patógeno asociado a la industria en cuestión. Algunas sugerencias son: Listeria para RTE, E. coli para cárnicos, Campylobacter para aves, Salmonella para huevos, S. aureus para un panificado. Esta decisión debe estar basada en un análisis de riesgos.
3. Determinar el tamaño de la muestra. Identificar la magnitud que se evaluará un área y cuánto producto será necesario.
4. Establecer un mecanismo de control. ¿Las medidas se tomarán antes y después, o se realizarán estudios paralelos? 
5. Determinar la duración del estudio. 
6. Establecer programas de muestreo microbiológico.  El diseño de un adecuado plan de muestreo validado, que represente estadísticamente el tamaño a muestrear es la clave de este desarrollo.
7. Evaluar los resultados.

Uno de los mayores problemas para detectarlos, es que los biofilms tienden a “des escamarse” de los equipos al azar, haciendo difícil encontrar un bajo nivel de contaminación. Esto no es similar a p.e., un tanque de jugo de manzana todo contaminado. En tal caso, todo el contenido tendría cierto nivel del microorganismo presente.

En cambio, la contaminación aleatoria de equipos mal limpiados — especialmente los equipos con un pobre diseño  sanitario — tiende a ser irregular. Ciertas etapas de la producción pueden ser más probables que muestren la contaminación que otros, pero esto depende del producto y método de operación. No sólo tiene que estar un equipo diseñado para una fácil limpieza, sino también se debe desinfectar mediante un método que interrumpa los biofilms.

Un buen programa de muestreo de equipo, después del lavado, ayudará a detectar áreas con problemas, sobre todo después de que el desinfectante se ha disipado, permitiendo a las bacterias crecer. Por ejemplo, el lunes por la mañana después de un cierre de fin de semana es un buen momento para muestrear. La contaminación en zonas de difícil acceso no aparece inmediatamente después de un lavado. A veces es necesario correr la línea durante unos minutos antes de muestrear, para encontrar estas áreas. Un problema persistente con ninguna causa específica en una zona puede requerir remover todo el equipo antes de que se encuentre el defecto. También es posible que otra fuente, como el condensado de superficies aéreas, esté re-contaminando los equipos.

En la industria de alimentos, la organización independiente NSF International (www.nsf.org), ha estado desarrollando normas para el equipo de servicio de alimentos durante 85 años.

Conclusión

La investigación en biofilms en patógenos en alimentos está llevando a cabo en muchos frentes, con especial hincapié en la elucidación de los genes expresados específicos durante la fase de biofilm, evaluación de diversas estrategias de control para evitar o remediar su colonización. Sin duda surgirán estrategias innovadoras para  su prevención y control. La clave del éxito puede ser una comprensión más completa de lo que hace tan diferentes entre el fenotipo de un biofilm al de vida libre.

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Referencias

1. Jornada ‘Detección, control y eliminación de biofilms en la industria alimentaria’.07 02 2011, IRTA, BCN, España.
2. Battling Biofilm: Surface Science, Antimicrobials Help Combat Medical Device-Related Infections By Kelly M. Pyrek, Infection Control Today
3. «Bacterial Biofilms Less Likely on Electropolished Steel» was published in the February 1998 issue of Agricultural Research magazine
4. SANITATION. Beating Back Biofilms in Food Processing . By Richard F. Stier, Food Safety Magazyne, 2005
5. Attachment of Escherichia coli O157:H7 in ground beef to meat grinders and survival after sanitation with chlorine and peroxyacetic acid. Farrell BL, Ronner AB, Wong AC. J Food Prot. 1998 Jul;61(7):817-22,
6. Biofilm Antibiotic Resistance May be Susceptible to Genetic Approach, www.rapidmicrobiology.com/news/0311242.php
7. SANITATION Biofilms: Our Constant Enemies  By John N. Sofos, Ph.D. FSM, February/March 2009 (ver mas en este)
8.  Safety Of Chilled Foods, By: Bruce M. Floyd, 05 2000, Weeks Publishing Company
9. Biofilm formation and sporulation by Bacillus cereus on a stainless steel surface and subsequent resistance of vegetative cells and spores to chlorine, chlorine dioxide, and a peroxyacetic acid-based sanitizer. Ryu JH, Beuchat LR, : J Food Prot. 2005 Dec;68(12):2614-22
10. Formation of biofilms by Listeria monocytogenes under various growth conditions, : J Food Prot. 2005 Jan;68(1):92-7. Moltz AG, Martin SE.
11. Research Note:Evidence for Escherichia coli O157:H7 Attachment to Water Distribution Pipe Materials by Scanning Electron Microscopy.  MAFU AKIER ASSANTA,^{a, b} DENIS ROY,^a MARIE-JOSÉE LEMAY,^{a, b} and DIANE MONTPETIT^a. Journal of Food Protection: Vol. 65, No. 12, pp. 1970–1975
12. Inactivation and removal of Bacillus cereus by sanitizer and detergent, Int J Food Microbiol. 2002 Jul 25;77(1-2):11-8. Peng JS, Tsai WC, Chou CC.
13. YliH (BssR) and YceP (BssS) regulate Escherichia coli K-12 biofilm formation by influencing cell signaling. : Appl Environ Microbiol. 2006 Apr;72(4):2449-59 Domka J, Lee J, Wood TK.

Autora del artículo:

Leila Burin. 
Coordinadora Académica de Portal de Inocuidad.
PhD en Ciencias Químicas, Universidad de Buenos Aires, 2001 y Lic. en Ciencias Biológicas, Universidad de Buenos Aires, 1994. 2010 hasta la fecha: auditora para SAI Global Spain: Esquemas: IFS, BRC, ISO 22 000, FSSC 22000, GMA SAFE y auditorías de clientes: Unilever, Pepsi, Starbucks, Woolworths, Mac Donalds. 1997 hasta la fecha: QualyFoods S.A., Argentina Cargo: Gerencia Técnica en Aseguramiento de Calidad. Dirección. Desarrollo de Programas de Pre-requisitos & BPM y HACCP en Argentina (8 Plantas); capacitación: HACCP Alliance Lead Instructor en Argentina y México; y auditora para Heinz NA. Mas de 15 cursos abiertos dictados desde 2001. Docencia: Materia: Biología e Introducción a la Biología Celular. Unidad Académica: CBC (Ciclo Básico Común), UBA, entre 1993 y 2000. 2 Direcciones de Tesis, entre 2001 y 2006. 14 Publicaciones y artículos. 18 Trabajos presentados a congresos. Más de 35 cursos tomados desde 1994. 

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